成功案例詳解！基因組及重測序助力野生枇杷基因組進化和果實馴化規律研究！

2022年12月，西南大學梁國魯教授團隊完成了野生枇杷高質量基因組和種質資源重測序研究，相關研究成果“Genome assembly of wild loquat (Eriobotrya japonica)?and resequencing provide new insights into the genomic?evolution and fruit domestication in loquat”發表于園藝學國際頂刊期刊《Horticulture Research》上。百邁客有幸參與了該研究，完成了其中基因組、群體和轉錄組測序及分析等工作。

?

研究背景

枇杷是全世界最受歡迎的果實之一，它與蘋果、梨、草莓等經濟物種同屬于薔薇科。枇杷起源于中國，已種植了2000多年，現已廣泛分布在全球30多個國家，其水果含豐富的營養物質，包括糖類、氨基酸、維生素、有機酸和礦物質等。此外，其果實在食品工業中也常用來制作果汁、葡萄酒、糖漿和果醬。枇杷在進化和馴化歷史上一直存在爭議。目前，野生枇杷為系統進化和育種提供了大量寶貴的遺傳資源，野生和栽培種質間的遺傳變異變異研究有助于更好地了解作物物種的馴化過程，同時也為功能基因鑒定提供有效的途徑，后期可以更好地應用于遺傳改良。然而，由于復雜的遺傳背景和悠久的栽培歷史，野生枇杷和栽培枇杷之間的基因組進化規律仍不清楚。

材料方法

Denovo：~159.8 Nanopore?reads（~198.5×），IIIlumina reads，Hi-C，~8G?RNA-seq?data基因組注釋

重測序：26份栽培枇杷和11份野生枇杷，Illumina測序，~22.49×

轉錄組：果實未成熟（GF）、果實轉色（CT）和果實成熟（FR）3個時期轉錄組分析

代謝組：Jinhua No. 2 FR與GZ-23 FR，Huabai No. 1 FR與GZ-White FR，?LC-MS/MS廣靶

研究結果

1、野生枇杷GZ-23基因組的組裝及注釋

作者對野生枇杷（Eriobotrya japonica?Lindl.）（2n = 34）的基因組進行了研究，與流式細胞儀預估的結果（～760Mb）相一致，k-mer分析結果顯示基因組大小為737.06 Mb。隨后，利用152.6 Gb的ONT數據（reads N50 = 31.6kb）進行基因組組裝，同時利用二代數據糾錯和Hi-C數據掛載，成功組裝了分布在17條染色體上的783.7 Mb的野生枇杷基因組序列（圖1）；其中，scaffold N50和contig N50分別為41.8Mb和3.9Mb。二代轉錄組的回比率為98.7%，CEGMA和BUSCO評估分別為98.03%和98.27%，表明GZ-23基因組組裝的完整性較好（表1）。進而結合從頭預測、同源比對預測和轉錄組輔助預測，共預測到45,791個基因，鑒定到59.75%的基因組重復序列，此外，還鑒定出5381個rRNAs、765個tRNAs和129個miRNAs。

 

2、野生枇杷與12個物種的比較基因組分析

為研究野生枇杷基因組特征及進化，作者將其與藍星睡蓮、水稻、鐵皮石斛、番茄，茶樹、獼猴桃、蘋果、白梨、野草莓、擬南芥，杧果和葡萄基因組進行比較基因組分析，通過基因家族聚類，發現92%（42,150）的蛋白編碼基因聚為20,668個基因家族，其中523個基因家族為枇杷特有的單拷貝（圖2A），主要參生物學質量調控、激素水平、定位、運輸和生長素極性運輸等生物過程。通過4DTv和Ks對全基因組復制事件分析表明，枇杷基因組中發生了兩次全基因組復制（WGD）事件，最近的WGD事件發生在30-45 Mya，而古WGD可能發生在已知的約120~130 Mya的古六倍化WGT(γ)事件。系統分化表明，枇杷與蘋果和梨擁有共同的祖先，這三個物種的分化發生在最近的一次WGD事件之后，通過比較分析，枇杷基因組104個基因家族發生擴張，僅有一個基因家族發生收縮，GO富集分析表明，發生擴張的基因家族主要參與花粉識別、分生組織發育與維持、免疫反應、和DNA代謝過程的調節等生物過程；KEGG分析表明，主要參與半乳糖代謝、氨基酸代謝、氨基糖/核苷酸糖代謝、氮代謝、不飽和脂肪酸生物合成等通路。收縮的基因家族的生物學過程只參與了蛋白質磷酸化。

3、枇杷種質多樣性研究

對26個典型的枇杷栽培種質資源（代表全球不同地區的栽培種質資源）和11個來自中國西南地區的野生種質資源進行了全基因組重測序，平均深度為22.49×，共鑒定出10,978,138個高質量的SNP。系統發育和主成分（PCA）分析表明，野生種質和栽培種質聚為兩個不同的組（圖3A和B）。野生枇杷的核苷酸多樣性(π)（2.28×10^?3）高于栽培枇杷（1.44×10^?3），LD衰減速度快于栽培枇杷（圖3C），期望雜合度和觀測雜合度的平均值均顯著高于栽培枇杷。進一步利用Structure對種群結構分析顯示，當K=2時，所有個體被清楚地細分為野生和栽培種質的兩個特定分支（圖3D）。

果實品質和色澤是枇杷的重要農藝性狀，選擇清除分析結果鑒定到283個受選擇區域，包含2,381個基因，這些基因功能主要涉及糖、有機酸、脂肪酸、氨基酸、類黃酮、類胡蘿卜素和植物激素的生物合成和代謝途徑（圖4D），參與果實品質與色澤。同時，收到選擇的還有果實大小相關的基因如BZR1、BZR2、IAA26、NAC、SAUR32和SAUR72等。另外，這些基因在淀粉和蔗糖代謝、碳代謝、果糖和甘露糖代謝、植物-病原體相互作用、脂肪酸代謝、苯丙素生物合成、類黃酮生物合成、類黃酮生物合成、類胡蘿卜素生物合成和植物激素信號轉導等通路顯著富集。綜合這些結果，作者提出了一種獨特的枇杷果實品質和果肉顏色的馴化模式。

4、枇杷果實中基因表達特性研究

栽培枇杷的果實味道優于野生枇杷，為了確定參與果實品質的關鍵調控基因，作者對果實發育和成熟的三個階段（即果實未成熟（GF）、果實轉色（CT）和果實成熟（FR））進行了比較轉錄組分析。在3個發育階段共表達了23,275個基因，其中5,435個基因表達存在顯著差異（圖5A和B），這些差異表達基因（DEGs）可能有助于果實的獨特特征，主要富集在淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉導、MAPK信號通路等途徑。與野生枇杷相比，栽培枇杷在果實發育過程中主要在糖代謝、植物激素信號轉導、類黃酮生物合成和類胡蘿卜素生物合成等途徑富集（圖5C和D）。其中，淀粉和蔗糖代謝相關基因均在栽培枇杷的CT和FR期顯著上調（圖5E）。同時，發現大多數類胡蘿卜素生物合成相關基因，在紅色果實中表達明顯高于白色果實，與長期以來認知一致，即枇杷的紅色果肉是類胡蘿卜素積累的結果。

5、枇杷果實中代謝產物變化研究

為了確定FR階段的代謝變化，作者基于廣泛靶向的LC-MS/MS對野生枇杷和栽培枇杷進行了代謝組研究，共鑒定出1040種代謝物，利用層次聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）對4種枇杷果實的代謝產物進行了分類，發現野生枇杷和栽培枇杷在果實發育過程中代謝產物譜存在顯著差異。Jinhua No. 2 FR與GZ-23 FR的代謝組學分析顯示，共有371個差異積累代謝物（DAMs），其中149個上調，222個下調（圖6D）。但是野生枇杷中一些重要的類黃酮類化合物均顯著上調。Huabai No. 1 FR與GZ-White FR比較，共有413個DAMs表現出顯著差異，其中上調63個，下調350個（圖6C）。其中，鼠李糖、棉子糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和肌醇在白肉枇杷中顯著上調。有機酸中，茉莉酸和2-吡啶甲酸在白葉枇杷中顯著上調（圖6E）。

最后，為了進一步準確了解成熟果實中轉錄水平與代謝物變化之間的關系，作者進行了DEGs與DAMs之間的相關分析，其中，變化趨勢相同的DEGs和DAMs主要涉及類黃酮、酚酸類、氨基酸及其衍生物、萜類、有機酸、脂類等（圖7）。

總結

野生枇杷為改良品種的馴化和育種研究提供了豐富的遺傳資源。作者組裝出第一個野生枇杷染色體水平的基因組，比較基因組研究表明枇杷與蘋果和梨擁有一個共同的祖先，且在枇杷分化之前就發生了一次WGD事件。基因組重測序結果表明，野生枇杷較栽培枇杷具有較高的遺傳多樣性，果實質量、大小和葉片顏色相關性狀基因在馴化過程中受到了選擇。進一步通過轉錄組和代謝組分析鑒定到野生和栽培枇杷在果實發育不同階段的DEGs和DAMs，關鍵差異基因和代謝物主要涉及糖代謝、植物激素信號轉導、類黃酮和類胡蘿卜素生物合成。這些高質量的參考基因組、重測序、轉錄組和代謝組分析為闡明枇杷的果實馴化和分子育種研究提供了有利保障。

原文鏈接：https://doi.org/10.1093/hr/uhac265